» Методы диагностики инфекционных заболеваний » Полнморазная цонная реакцня

Полнморазная цонная реакцня



Принцип метода ПЦР состоит в многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемом in vitro термостабильной ДНК-полимеразой в автоматическом режиме. Этот процесс называют направленной амплификацией ДНК. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода. Применение методов детекции продуктов амплификации (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

ПЦР имеет три технологические стадии:

- выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка);

- амплификация;

- регистрация результатов амплификации.

Вторая стадия ПЦР — циклическая амплификация — протекает поэтапно при определённой температуре реакционной смеси.

Образовавшиеся в каждом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов, при этом число копий ДНК нарастает в геометрической прогрессии (2П, где п — число прошедших циклов амплификации). Описанные процессы протекают в термоциклере — программируемом термостате, по заданной программе осуществляющем смену температур согласно числу циклов амплификации.

Визуализацию результатов ПЦР осуществляют электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном геле или методом гибридизации ампликонов с комплементарным к определяемой последовательности олигонуклеотидным зондом, меченным флюоресцентной, ферментной или другой меткой. Принципиально новое направление развития регистрационных систем — использование оптических биосенсоров, позволяющих определять в ходе гибридизации в реальном режиме времени пикограммовые количества фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической кюветы.

Достоинства ПЦР:

- высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток в пробе;

- высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

- универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе;

- высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификаци дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч;

- возможность проводить количественный анализ и определять число копии специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции);

- возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Материалом для постановки ПЦР могут быть кровь, сыворотка крови, лимфоциты, биоптаты, СМЖ, моча. При сборе крови для ПЦР важны следующие условия:

- нельзя использовать гепарин в качестве антикоагулянта, так как он ингибиру-ет ферменты и снижает чувствительность реакции;

- для предотвращения свёртывания крови применяют ЭДТА или цитрат натрия;

- кровь нельзя помещать в холодильник (+4 °С);

- для определения вирусной нагрузки транспортировку крови следует осуществлять в максимально короткие сроки (до 6 ч) при температуре +18-22 °С.

Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа.


Copyright © infectos.ru
Эффективная защита от вирусов. Инфекционные заболевания. Диагностикий центр.